abt Predstavujeme laboratóriá Výskumného centra AgroBioTech.

V Laboratóriu genetických analýz sa nachádza špičkové prístrojové vybavenie pre výskum v oblasti molekulárno-genetických analýz s využitím techník ako je PCR, RTPCR, real-time PCR, microarray a určovanie primárnej štruktúry DNA sekvenovaním. Gestorom laboratória je Ing. Peter Socha, PhD.

PCR (polymerázová reťazová reakcia) je v súčasnosti vďaka svojej vysokej citlivosti, špecifickosti a rýchlosti jednou z najviac používaných techník molekulárnej biológie. Často sa označuje ako metóda, ktorá spôsobila revolúciu v molekulárnej biológii, a ktorá našla široké uplatnenie nielen v základnom výskume, pri klonovaní a analýze DNA, ale aj v aplikovanom výskume a laboratórnej diagnostike. Metodiky na báze PCR slúžia pre rýchle zmnoženie konkrétneho úseku DNA, ktorý je z oboch strán ohraničený primermi (krátke oligonukleotidové sekvencie DNA). PCR reakcia pozostáva z troch krokov: denaturácia (rozpletenie dvojzávitnice molekuly DNA), hybridizácia (naviazanie primerov) a elongácia (rast DNA vlákna). Všetky tri kroky predstavujú jeden cyklus, ktorý sa cyklicky opakuje, a tak vznikne produkt reakcie. Analýzy DNA možno uskutočniť aj z veľmi malého množstva vzorky, pričom výsledkom analýzy je získanie niekoľko miliónov presných kópií vzorového fragmentu DNA. K syntéze nového vlákna DNA sa najčastejšie používa termostabilná DNA polymeráza z baktérie Thermus aquaticus. PCR prebieha v zariadení, ktoré sa nazýva termocyklér, a ktoré je navrhnuté tak, aby dokázalo meniť teplotný profil reakcie v priebehu niekoľkých sekúnd.

RT-PCR je metóda, pri ktorej sa PCR produkt získava reverznou transkripciou a slúži na kvalitatívnu detekciu génovej expresie. Je to jedna z najcitlivejších metód na detekciu malých množstiev mRNA (mediátorovej RNA). Princípom metódy je izolácia RNA, ktorá bude slúžiť ako templát pre reverznú transkripciu a syntézu prvého vlákna komplementárnej DNA (cDNA), samotná reverzná transkripcia a namnoženie produktu pomocou PCR reakcie. Táto metóda je technicky náročnejšia na prevedenie ako samotná amplifikácia DNA, keďže molekula RNA sa rýchlo degraduje účinkom ribonukleáz, ktoré sú častými kontaminantmi vzoriek, chemikálií a pomôcok. Aby sa zabránilo degradácii RNA, ošetrujú sa roztoky a pomôcky rôznymi inhibítormi. Real-time PCR alebo qPCR (kvantitatívna PCR) slúži na kvantitatívnu detekciu určitej sekvencie vznikajúceho PCR produktu po každom cykle s využitím fluorescenčných prób. Pre priebeh real-time PCR je potrebný špeciálny typ termocykléru s detektorom fluorescencie, ktorý je tiež súčasťou Laboratória genetických analýz. Tento špeciálny termocyklér meria zväčšujúce sa množstvo DNA v reakčnej zmesi alebo množstvo značky hybridizujúcej k cieľovej sekvencii PCR produktu. Na základe toho rozlišujeme dva druhy detekcie fluorescenčného signálu, SYBR Green a TaqMan. Kým SYBR Green je špeciálne fluorescenčné farbivo viažuce sa na templát DNA, metóda TaqMan využíva krátke oligonukleotidy komplementárne k sekvencii špecifického PCR produktu. Táto metóda nachádza veľmi široké uplatnenie, konkrétne v našom laboratóriu sa používa na identifikáciu bodových mutácií súvisiacich s úžitkovými vlastnosťami rastlín a živočíchov, na identifikáciu rôznych potravinových intolerancií a na identifikáciu genotypovej charakteristiky.

Súčasťou laboratória je aj SureScan Dx Microarray Scanner od firmy Agilent Technologies, využívajúci technológiu SureScan, ktorá umožňuje rýchle, vysoko kvalitné a automatizované skenovanie microarrays. SureScan skener je sofistikovaný fluorescenčný skener indukovaný laserom, ktorý je navrhnutý pre čítanie microarrays vytlačených na štandardných sklíčkach (25 mm x 75 mm). Meria intenzitu fluorescenčne značenej nukleovej kyseliny (DNA alebo RNA) naviazanej na microarrays. Jeho schopnosť merať fluorescenciu z dvoch farbičiek zároveň uľahčuje štúdie dvojfarbičkových microarrays. Technológia, ktorú využíva SureScan skener ponúka široké spektrum microarray aplikácií pre cytogenetiku, génovú expresiu a špecifickú analýzu (miRNA, ChIP-on-chip, exón, DNA metylácia).

V laboratóriu sa nachádza aj špičkový sekvenátor novej generácie Illumina NextSeq 500 umožňujúci tzv. „high-throughput“ sekvenovanie exómov, celých genómov a transkriptómov. Táto revolučná metóda sekvenovania novej generácie (NGS) je založená na možnosti realizácie paralelnej sekvenačnej analýzy veľkého množstva DNA fragmentov. NextSeq 500 sekvenátor predstavuje systém, ktorý v sebe spája tvorbu klastrov a zároveň samotné sekvenovanie. Primárna analýza, stanovenie báz (base- -calling), zahŕňa konvertovanie biochemických signálov, ktoré boli získané snímaním zmien svetelnej intenzity (fluorescencia) do krátkych nukleotidových sekvencií. Počas samotného sekvenovania sú nukleotidy fluorescenčne značené: C nukleotidy červenou farbičkou, T nukleotidy zelenou farbičkou, A nukleotidy kombináciou červenej a zelenej farbičky, čím vznikne žltý obraz. G nukleotidy nie sú značené. Next- Seq 500 sekvenátor využíva novú dvojkanálovú SBS (sequencing by synthesis) technológiu pre determináciu všetkých štyroch nukleotidových báz zosnímaním iba dvoch obrazov (červeného a zeleného). Sekundárnou analýzou sa zabezpečuje porovnávanie získanej sekvencie s referenčnou a anotácia nukleotidov. Dáta sú automaticky transferované do BaseSpace prostredia, čo je on- -line prostredie na stránke Illumina pre ich ďalšie spracovanie, uchovávanie a zdieľanie. V budúcnosti plánujeme sekvenátor využiť napríklad pri monitorovaní génov rezistencie v poľnohospodárskych plodinách.