abt1 S gestorom Laboratória mikroskopických analýz Ing. Jaromírom Vašíčkom, PhD., a jeho spolupracovníčkou Ing. Lenkou Kuželovou, PhD.

Jaromír Vašíček: V Laboratóriu mikroskopických analýz, ako hovorí samotný názov, sa nachádzajú špičkové mikroskopy rôznych druhov. K základnému vybaveniu patria optické svetelné mikroskopy a inverzný svetelný mikroskop s fázovým kontrastom pre pozorovanie bunkových kultúr. K štandardnému vybaveniu podobných laboratórií už v súčasnosti patrí aj inverzný fluorescenčný mikroskop.

Lenka Kuželová: Fluorescenčný mikroskop je v mnohých parametroch podobný svetelnému mikroskopu, no disponuje pridanými funkciami. Princípom fluorescenčnej mikroskopie je schopnosť niektorých látok (fluorochrómov) po ožiarení (excitácii) svetlom absorbovať svetlo určitej vlnovej dĺžky a následne vyžarovať (emitovať) svetlo dlhšej vlnovej dĺžky. V prírode sa vyskytujú prípady autofluorescencie, keď určité látky pri ožiarení UV svetlom emitujú svetlo (napr. chlorofyl emituje pri UV ožiarení červené svetlo). Na zviditeľnenie buniek a molekúl, ktoré nemajú autofluorescenciu využívame fluorescenčné farbenie. Technika fluorescenčnej mikroskopie je vďaka svojim vlastnostiam esenciálnym nástrojom v biológii a medicínskych vedách, ako aj vo vede materiálnej. V bunkovej biológii môžeme fluorescenčnú mikroskopiu využiť na identifikáciu bunkových organel, zviditeľnenie niektorých bunkových štruktúr (jadro, cytoskelet), alebo na sledovanie biochemických dejov. Pomocou nej môžeme diagnostikovať a lokalizovať poškodenia buniek, tkanív, orgánov. V oblasti mikrobiológie nám slúži na identifikáciu rôznych bakteriálnych rodov.

J. V.: V našom laboratóriu sa nachádza aj unikátny typ mikroskopu, tzv. transmisný elektrónový mikroskop (TEM) JEOL 2100, ktorého obrovskou prednosťou je jeho veľké rozlíšenie. Kým optické mikroskopy pracujú pri maximálne tisícnásobnom zväčšení, TEM dokáže zobraziť vzorku pri zväčšení až 1 500 000krát. Takto možno napr. veľmi ľahko študovať základnú stavebnú jednotku každého živého organizmu – bunku, pozorovať jednotlivé jej organely, ktoré pracujú podobne ako orgány nášho vlastného tela. Napr. jadro spolu s jadierkom sú mozgom a srdcom samotnej bunky, mitochondrie zodpovedajú za jej dýchanie a iné rôzne organely, ktoré spracovávajú alebo produkujú rozličné biologické látky potrebné pre existenciu samotnej bunky a zároveň aj celého organizmu. Zjednodušený princíp TEM spočíva v tom, že usmernený lúč elektrónov zo zdroja vysokého napätia (200 kV) prechádza vo vákuu veľmi tenkou vzorkou. Elektróny pri prechode reagujú so vzorkou, pričom vytvárajú jej obraz. Vzniknutý obraz sa zväčšuje a zaostruje na zobrazovacom zariadení, ktorým môže byť fluorescenčné plátno, alebo je obraz zachytený pomocou CCD kamery a premietnutý na monitor počítača. TEM nám teda umožňuje rozoznávať vnútornú ultraštruktúru biologickej vzorky pri oveľa väčšom rozlíšení ako ponúkajú klasické svetelné mikroskopy. Samotný prístroj však nie je automatizovaný a musí ho ovládať vyškolený pracovník, ktorý správne nastaví smer elektrónového lúča prechádzajúci cez sústavu elektromagnetických šošoviek a elektrostatických platní.

L. K.: Aj prípravu vzorky pre TEM, ktorá je tiež pomerne zložitá a časovo náročná, zabezpečuje len vyškolený pracovník. Preparáty musia mať optimálnu hrúbku 60 – 70 nm. Dôležitým krokom v príprave vzoriek je teda krájanie zaliatych preparátov na rezy takejto hrúbky, ktoré sú označované ako ultratenké. Možno ich narezať len na špeciálnom prístroji nazývanom ultramikrotóm, ktorý je tiež súčasťou nášho laboratória.

J. V.: Ultratenké rezy biologickej vzorky sa nanášajú na okrúhle kovové sieťky s priemerom 3 mm, ktoré môžu byť z niklu, medi, zlata atď., vhodne zvolené podľa druhu vzorky. Vkladajú sa do špeciálneho držiaka. Existuje niekoľko typov držiakov určených na rôzne analýzy. Naše laboratórium disponuje držiakom na klasickú TEM a držiakom pre tomografické aplikácie. TEM okrem základného TEM módu disponuje aj jednotkou STEM a tomografickým softvérom. STEM je vlastne skenovacia transmisná elektrónová mikroskopia, ktorá umožňuje rozlíšenie až na atómovej úrovni pri zväčšení až 5 000 000- krát v tmavom poli. Výhodou STEM je, že umožňuje zobrazovanie biologických vzoriek s vysokým kontrastom bez potreby ich zafarbenia. Elektrónová tomografia zase umožňuje získať detailnú 3D štruktúru pozorovaných objektov. Lúč elektrónov prechádza vzorkou v rôznych uhloch rotujúcich okolo jej stredu. Zachytávaný signál potom vytvorí trojrozmerný obraz cieľového objektu. Táto technika umožňuje napríklad skúmať molekulárnu štruktúru rôznych proteínov. Správne fungovanie prístroja vyžaduje stabilnú teplotu prostredia 20 °C, pričom samotný prístroj je chladený dvoma chladičmi s uzavretým okruhom destilovanej vody. Okrem toho bolo treba zrealizovať špeciálne stavebné úpravy, aby sa zamedzilo negatívnemu vplyvu elektromagnetického poľa, vibrácií, zvukových vĺn atď. Aký je význam tohto špičkového mikroskopu pre prax? TEM nám umožňuje pozorovať ultraštruktúru biologických vzoriek (rastlinných či živočíšnych tkanív, resp. buniek, rôznych mikroorganizmov, baktérií, vírusov a pod.). Vďaka TEM môžeme študovať napr. zloženie bunkových organel v rôznych typoch buniek, rôzne morfologické abnormality buniek, poškodené bunkové membrány či organely, sledovať rôzne fyziologické bunkové deje (apoptózu, nekrózu, fagocytózu atď.), zloženie membrán na molekulárnej úrovni a pod. Takto môžeme vyhodnotiť napr. vzorky vhodné pre uchovávanie v banke genetických zdrojov. Veľmi zaujímavou aplikáciou je tiež imunoelektrónová mikroskopia, ktorá funguje na podobnom princípe ako značenie pre nepriamu imunofluorescenčnú mikroskopiu. Využívajú sa pri nej primárne protilátky špecifické pre určitý antigén alebo inú časť bunky. Na primárne protilátky sa potom viažu sekundárne protilátky s koloidnými časticami zlata, ktoré reagujú s elektrónmi a vytvárajú tak obraz. Takto môžeme napr. získať informáciu o lokalizácii určitého antigénu na povrchu bunky na úrovni ultraštruktúry s veľmi vysokým rozlíšením. Okrem uvedených aplikácií sa TEM vo veľkej miere uplatňuje pre hodnotenie potravinárskych výrobkov. Umožňuje študovať vnútornú štruktúru rôznych pevných, či polotekutých potravín (syry, jogurty atď.), ale aj tekutých potravín, ako je napr. mlieko, či zmrazených, ako je zmrzlina. Zároveň môžu byť pozorované rôzne užitočné baktérie v potravinách (napr. mliečne baktérie), ako aj potravinové patogény (napr. Salmonella a Campylobacter).

L. K.: V súčasnosti sa v našom laboratóriu venujeme kultivácii a hodnoteniu kmeňových buniek izolovaných z embryí kurčiat plemena oravka. Analýzy prebiehajú v rámci riešenia projektu APVV „Kryouchovávanie živočíšnych genetických zdrojov“, v ktorom je hlavným riešiteľom prof. Ing. Peter Chrenek, DrSc. Využitie kmeňových buniek je perspektívnou možnosťou zachovania ohrozených druhov (plemien) zvierat. Ich využitiu samozrejme predchádza odber, kultivácia buniek v podmienkach in vitro s cieľom namnoženia, otestovania originality a kvality s následným zmrazovaním.